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标记定量蛋白质组iTRAQ&TMT

产品介绍

    标记定量蛋白质组iTRAQ&TMT

    标记定量蛋白质组iTRAQ&TMT介绍

    研究不同生理和病理条件下细胞内蛋白质的含量和状态变化是比较蛋白质组学的核心内容。iTRAQ(isobaric tags for r elative and absolute quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)分别是由美国AB Sciex公司和Thermo公司研发的多肽体外标记定量技术,是目前运用最广泛的两种标记定量蛋白质组技术,分别通过与氨基酸末端氨基以及赖氨酸残基的游离氨基结合,实现对多肽的标记,并通过不同分子量的试剂对不同来源样品进行标记的方式实现不同样品间蛋白质组比较的目标。


    青岛欧易母公司-上海欧易特色

    ● 定量准确:可以检测最少5%的差异

    ● 重复性好:组间重复性可达90%以上

    ● 数据丰富:一次实验可得到上千个蛋白的定性和定量信息

    ● 通量高:iTRAQ可同时标记8个不同样品,TMT最多可标记10个样品


    标记定量蛋白质组iTRAQ&TMT技术路线

    iTRAQ技术路线-欧易生物
    TMT技术路线-欧易生物
    iTRAQ技术路线
    TMT技术路线


    标记定量蛋白质组iTRAQ&TMT原理介绍


    iTRAQ与TMT试剂均由报告基团、中性平衡基团和反应基团三部分组成。不同报告基团及其相对应平衡基团的质量和都相同,而反应基团能与赖氨酸ε-氨基和所有肽链的氨基末端连接,可标记所有氨基酸。不同标记试剂与来源于不同样品胰酶消化后的肽段结合,经过色谱分离,并通过一级质谱和二级质谱分析。平衡基团在二级质谱时发生中性丢失,而报告基团在二级质谱低质量区域产生多个报告离子,其信号强度分别代表该标记样品的表达量,根据报告离子的峰面积计算同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值,从而实现蛋白的相对和绝对定量。


    标记定量蛋白质组iTRAQ&TMT项目流程



    标记定量蛋白质组iTRAQ&TMT项目流程-欧易生物


    标记定量蛋白质组iTRAQ&TMT质谱平台


    ● TripleTOF 5600

    ● Q-Exactive


    数据分析内容


    ● 数据质控(归一化、聚类分析、相关性分析、主成分分析)

    ● 蛋白质谱搜库检索 ● 差异表达蛋白质筛选

    ● 常规生物信息学分析(GO富集分析、KEGG通路分析、PPI分析)


    标记定量蛋白质组iTRAQ&TMT样品要求


    ● 蛋白提取物:浓度>1 μg /μL,蛋白质总量>500 μg

    ● 细胞:5×10^6个

    ● 微生物:500 mg

    ● 组织样品(湿重):植物200 mg,动物100 mg

    ● 血清和血浆等体液:200 μL


    常见问题


    ● 1.没有全基因组数据的物种该如何进行蛋白的鉴定?
    对于已经公布全基因组序列的物种,可以在得到全序列后构建本地建库并进行本地检索;对于未进行全基因组测序的物种,可以采用近缘物种的数据库或者EST数据以及转录组数据进行检索。


    ● 2.iTRAQ及TMT等标记定量蛋白质组技术有什么特点?
    iTRAQ以及TMT等标记定量蛋白质组技术分辨率高,细胞样品最多可鉴定超过6000个蛋白,并且绝大多数蛋白都有定量和定性信息;其次是通量高,可以一次最多完成8个(iTRAQ)或者10个(TMT)样品的实验,特别适合于多组样品间的同时比较以及生物学过程的动态检测。


    ● 3.iTRAQ及TMT实验中增加混合样本组的优势是什么?
    由于混合样本是所有样品的等量混合,它包括所有样品的蛋白信息,其性质介于所有样品之间。可以视其为基准,其他样品和混合样之间的相对定量就可以视为某个蛋白样品的表达量,有利于直接查看蛋白在不同样品之间表达量的趋势变化和方便后续分析。


    ● 4.组学数据后续一般如何进行生物信息学分析?
    主要的分析包括基于统计的主成分分析、聚类分析、表达模式挖掘等,另外还包括基于生物学意义的GO功能分析,COG功能分析、Pathway代谢通路富集、蛋白互作、转录因子预测、代谢物功能回溯、相关模型和网络构建等深入分析。


    案例展示


    案例一:假乳头状肿瘤蛋白组分析揭示内质网加工功能障碍

    研究背景:

    假乳头状肿瘤(SPTP)是一种少见的具有低度恶性潜能的实体性肿瘤,临床上发病率低且术前诊断较为困难,存在较多的误诊与误治。以往的研究常关注SPTP的临床特征及生物标志物的搜寻,然而SPTP发生的潜在分子机制研究鲜有报道。


    研究内容:

    本文分别搜集了5例SPTP病人的癌与癌旁组织。作者将5组癌组织混合后分成3等分,同样的,将5组癌旁组织混合后也分成3等分,并设置了癌组织与癌旁组织的混合样作为内标组,最后得到7组样品进行蛋白提取及iTRAQ标记。通过LC-MS/MS分析,作者在癌与癌旁样品间一共鉴定到1171个差异表达蛋白质(>1.5倍,P≤0.05)。进一步对差异表达蛋白质进行GO富集分析和KEGG分析,发现内质网应激通路可能在SPTP成瘤过程中起重要作用,作者选取该通路中鉴定到的7个蛋白进行IHC验证,IHC结果与iTRAQ定量结果一致。

    GO富集分析、KEGG分析及IHC检测显示内质网加工功能障碍是SPTP重要致病因素-欧易生物

    GO富集分析、KEGG分析及IHC检测显示内质网加工功能障碍是SPTP重要致病因素

    研究结果:

    从蛋白组水平进一步证实细胞粘附是SPTP重要致病因素之一,发现了核糖体、内质网、补体和凝血级联反应等多个生物学过程与假乳瘤的关系,并对重点关注的内质网加工功能障碍对SPTP的影响做了深入分析。


    参考文献:

    Zhu Y, Xu H, Chen H, et al. Proteomic analysis of solid pseudop apillary t umor of t he pancreas reveals dysfunction of the endoplasmic r eticulum protein processing pathway. Molecular & Cellular Proteomics. 13:2593-2603(2014). (IF: 7.254)


    案例二:环境温度升高对微生物群落的影响

    研究背景:

    全球温度升高会对微生物群落造成影响,进而直接影响全球生态系统。科学家们在温度对微生物群落的群落结构和特定的代谢过程做了许多研究,而较少使用组学手段对整个群落的反应做出全面的评估。


    研究内容:

    本文首次将TMT标记定量蛋白质组学技术应用在微生物群落研究上,精确地和可重复地在40℃、43℃和46℃三个温度条件下定量到上千个微生物蛋白质。作者发现,温度升高会引起单个微生物和整个群落的氨基酸代谢相关蛋白质上调,并抑制两类螺菌属微生物的固碳蛋白表达,然而在高温下第三类螺菌属微生物固碳蛋白则显著上调。

    生物群落蛋白丰度变化分析-欧易生物

    生物群落蛋白丰度变化分析

    研究结果:

    定量蛋白质组学技术可以用于群落微生物研究,能鉴定到与代谢、生长、信号与压力反应等过程相关的上千个差异表达蛋白,并能在生态群落中对单个微生物组实现定量蛋白质组学研究。


    参考文献:

    Mosier A C, Li Z, Thomas B C, et al. Elevated t emperature alt ers proteomic responses of ind ividual organisms within a bio film community. The ISME journal. 9:180-194 (2015). (IF: 9.328)