Benjamin Izar团队：CRISPR 修饰细胞的单细胞、多组学read-outs
背景
Benjamin Izar 正试图弄清楚当免疫细胞遇到癌细胞时会发生什么。他从大型分子分析研究开始，例如全外显子组测序和 RNA-seq。“他们给出了几十个可能在疾病或药物反应中起作用的推定目标或机制，但不可能在功能上单独验证它们中的每一个，”他感叹道。
为了提供帮助，纽约哥伦比亚大学赫伯特欧文综合癌症中心的内科医生兼科学家 Izar 转向了 CRISPR 筛查。CRISPR 允许研究人员精确地改变细胞的 DNA 序列，并修改基因功能。使用高通量筛选，可以在单个实验中评估数千种扰动的影响。 这些工具通过帮助科学家识别导致疾病的编码和非编码区域的遗传变异来帮助研究和药物发现工作。
然而，到目前为止，在不同条件下（例如药物治疗或病毒感染）的 CRISPR 筛选的典型read-outs一直是非常简单的细胞生长和存活测定。这些read-outs揭示了基因调控，当受到干扰时，这些基因要么使受攻击的细胞敏感，要么赋予其选择性优势——但没有迹象表明它们是如何做到的。
新开发的技术提供了 CRISPR 修饰细胞的单细胞、多组学读数。“任何大规模的分析或筛选工作都可能受益于这些方法，因为它们有助于深入了解可能与功能相关的内容。Izar 说，通过这些“高内涵”的 CRISPR 筛选，研究人员可以开始评估无数提名的机制和目标。
高内涵 CRISPR 筛选将遗传扰动和刺激与数据丰富的单细胞测序和成像读数相结合。借助这些技术，研究人员可以以前所未有的细节表征筛选细胞，并获得对大规模遗传变异功能的新生物学见解。（见下图）
用于大规模变异功能分析的 CRISPR 筛选
要使基因组医学真正改变患者的医疗保健，了解遗传变异的临床相关性是关键。迄今为止，大多数努力都集中在研究许多癌症患者中常见的变异，事实证明这些变异没有预期的那么有用。麻省理工学院科赫研究所首席研究员 Jesse Boehm 说：“当你查看个体患者肿瘤的遗传数据时，大多数与癌症相关的突变实际上都非常罕见，这意味着我们对这些突变的作用知之甚少。”综合癌症研究和突破癌症基金会的首席科学官，旨在促进癌症中心之间的合作。
研究人员需要的是对基因功能进行公正的询问，他们可以使用 Perturb-seq 来做到这一点。这种技术将 CRISPR 扰动与转录组反应匹配。“这些技术的交汇处蕴藏着巨大的机遇。”Boehm 说。
Broad 研究所的 Boehm 及其同事使用 Perturb-seq 测量了两个非常常见的癌症基因TP53和KRAS中的 200 个变异对超过 300,000 个单个肺癌细胞1转录组的影响。他们发现单个变体可以对基因表达、下游分子途径和细胞状态产生广泛的影响，但可以根据它们对细胞过程的影响将变体分为不同的类别。
“我们展示了一种真正系统化且具有成本效益的方法来评估实验室中大量常见和罕见癌症变异的影响，”Boehm 说, “诸如 Perturb-seq 之类的方法将能够创建一个信息查找表，告诉我们每种癌症变体在推动肿瘤生长方面的作用。”
Boehm 是癌症依赖性地图项目的前任科学主任，该项目旨在系统地识别每种癌细胞中的遗传和药理学依赖性以及预测它们的生物标志物。针对这些新发现的癌细胞脆弱性可能会导致下一代癌症治疗。
这项工作与变异效应图集联盟的研究人员的工作密切相关，该联盟是一个国际联盟，旨在开发、传播和普及用于绘制变异效应图的技术，并协调生成高质量的变异-效果图。“因为这些类型的方法开始允许我们研究基因组任何部分和任何疾病环境中的遗传变异，它们为真正推进基因组医学提供了机会，”Boehm 补充道。
具有多维read-outs的 CRISPR 筛选也有助于研究药物敏感性和耐药性。Perturb-CITE-seq 是 Perturb-seq 的扩展，可提供有关 CRISPR 修饰细胞的 RNA 和蛋白质含量的信息。Izar 及其同事使用 Perturb-CITE-seq 来研究癌细胞对免疫疗法产生抗性的机制。 他们分析了超过 200,000 个源自患者的癌细胞，使用 CRISPR 破坏了数百个与免疫疗法耐药相关的基因2。在筛选之前，这些细胞与源自患者的肿瘤浸润淋巴细胞共培养。他们分析了单细胞转录组和 20 种表面蛋白，并能够识别大多数已知的耐药机制，例如与缺陷型 IFN-γ 信号传导相关的机制3。“Perturb-CITE-seq 预测的基因-基因和蛋白质-蛋白质相互作用的准确性验证了该方法，并使我们相信这是一种为重要生物学提供信息的可靠方法，”Izar 说。 使用这种技术，Izar 的团队还发现了新的癌症-免疫细胞相互作用，这可以解释为什么免疫检查点抑制剂在转移性黑色素瘤患者中失败或停止工作。他们的初步结果表明，没有已知的小鼠同系物的 T 细胞粘附蛋白 CD58 的破坏可能是抵抗 T 细胞介导的杀伤4的重要新机制。这种类型的知识可以帮助预测哪些患者不太可能对免疫检查点抑制剂产生反应，并为帮助克服某些患者的耐药性提供新的方法。 这些技术的另一个应用是改进细胞疗法。扰乱细胞并大规模产生高含量的表型信息使研究人员能够为特定的命运设计细胞。筛选某些转录因子过度表达的细胞将有助于研究人员更多地了解关键的分化步骤。如果他们能更好地指导干细胞成为特定的细胞类型，那么更适合的细胞疗法是可能的。 与许多尖端技术一样，成本是主要考虑因素。Daniel Schraivogel是欧洲分子生物学实验室 (EMBL )的研究人员，在德国海德堡的 Lars Steinmetz 实验室工作，他一直在研究 Perturb-seq 的修改版本，命名为靶向 Perturb-seq (TAP-seq)。专注于仅读取感兴趣的基因子集5。通过这样做，可以将测序要求降低多达 50 倍，并降低实验成本。 TAP-seq 还提高了灵敏度，因此可以更有效地检测低表达基因和小效应。Schraivogel 解释说，如果扰动的结果未知，则整个转录组的读数非常强大。“但在许多情况下，你知道哪些特定基因或过程可能会受到影响，因此根据这些调整你的读数是有意义的。” Schraivogel 及其同事使用 TAP-seq 来研究增强子的功能 - DNA 区域通常与远端启动子合作以控制靶基因转录。他们干扰了两个大基因组区域（人类基因组的 2.5%）中的增强子，并询问了对来自五种不同细胞类型的单个细胞中相同区域中表达基因的影响。迄今为止，已使用 Hi-C 等技术从 3D 空间中的相互作用预测增强子对靶基因的影响。然而，通过 TAP-seq，作者能够获得大约 80 个新的增强子-靶基因对6的直接功能证据。 他们测试的增强子中只有 4% 具有目标基因，但超过三分之一的目标蛋白质编码基因对增强子的调节有反应。“我们的发现与我们的理解一致，即增强剂对细胞类型非常具有特异性，并且可以发挥广泛的作用，”Schraivogel 说。由于 TAP-seq 和机器学习模型，作者正在进一步了解增强子-靶基因相互作用与疾病状态的相关性。 还可以对活细胞中遗传变异的影响进行成像。Schraivogel 使用超快速多通道荧光显微镜与流式细胞仪细胞分选相结合，以高达每秒 15,000 个事件的速度对细胞进行成像和分选。通过快速分离具有复杂细胞表型的细胞，包括具有不同定位蛋白质的细胞和处于不同有丝分裂阶段的细胞，这种支持图像的细胞分选 (ICS) 方法为 CRISPR 筛选增加了空间维度。 研究人员将 ICS 应用于他们的 CRISPR 筛选，以识别核因子 κB (NF-κB) 的调节因子，这是一种在细胞核和细胞质之间穿梭的快速作用且至关重要的转录因子。“我们现在能够在不到一天的时间内完成基于全基因组图像的筛选——与以前需要数周或数月的方法相比，这是一个很大的进步，”Schraivogel 说。“我们确定了已知和新的 NF-κB 调节因子，例如参与染色质重塑的基因，这些基因以前不涉及 NF-κB 信号传导。” 鉴于 NF-κB 的异常激活会导致慢性炎症、肿瘤发生和自身免疫性疾病，这些发现有望为开发针对一系列疾病的新药带来希望。 CRISPR 筛选的下一个前沿是从使用细胞系转向原代细胞和患者来源的细胞。这将使研究人员能够验证功能基因组图谱中出现的假设，并确定哪些目标与临床最相关。“看到所有这些技术融合在一起，以系统的方式研究遗传变异的功能，真是令人兴奋，”Izar 说， “我期待看到研究人员在未来几年使用它们的所有创造性方式。”
1. Ursu, O., et al. Nature Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-021-01160-7
2. Jerby-Arnon, L., et al. Cell 175, 984-997.e24 (2018).
3. Frangieh, C.J. et al. Nature Genet 53, 332-341 (2021). doi: 10.1038/s41588-021-00779-1.
4. Ho, P. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.03.21.485049 (2022).
5. Schraivogel, D. et al. Nature Methods 17, 629-635 (2020). doi:10.1038/s41592-020-0837-5
6. Schraivogel, D. et al. Science 375, 315-320 (2022). doi: 10.1126/science.abj3013
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