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文库构建?从小白到大神,一文看懂磁珠保存和使用的注意事项!

时间:2022-08-31   访问量:521

什么是磁珠?


磁珠的发明构想最初来自于挪威科技大学的化学家John Ugelstad,经过不断改造与完善,到目前已发展到纳米级别。磁珠的基础结构一般为三层,包括内层基质、中间层磁性物质(四氧化三铁)以及最外层官能基团修饰的高分子材料,因官能基团的不同,磁珠具有了不同的功能与应用。

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生物磁珠是指具有细小粒径的超顺磁微球,一般具有超强的顺磁性。

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保存及使用注意事项


目前我们在文库构建中常用磁珠来进行多余片段去除(链霉亲和素磁珠)、片段分选、文库纯化,也常用来进行DNA纯化,以去除杂质,降低杂质对构建文库的影响。磁珠保存及使用过程中有一些关键因素会影响回收效率,下面我们一起来看一下。


磁珠的保存

拿到磁珠后首先看下保存条件,我们目前使用的磁珠一般为4℃保存,过低的温度(如-20℃)会破坏磁珠表面修饰,影响磁珠抓取效率,长时间常温放置也会影响磁珠的回收性能,因此磁珠用完后请及时放回4℃。一些磁珠需要避光保存,也请注意。


使用前提前拿出平衡至室温

某些磁珠buffer为PEG,PEG分离效果易受pH、温度等影响,温度低PEG不易与水相完全互溶,所以磁珠使用前要平衡至室温。


使用前充分混匀

磁珠使用前务必充分混匀,否则影响磁珠抓取效率。部分磁珠容易沉降,分磁珠过程中要多注意磁珠状态,沉降后及时进行混匀,避免因磁珠过少,导致片段抓取不完全,影响下游实验。


磁珠比例

成品磁珠请按照说明书使用,特殊情况可咨询试剂公司后自行测试,自己配制的磁珠第一次使用前需使用Marker进行测试,确定最适比例。某些实验如片段分选步骤对磁珠比例要求比较严格,因此多样品时最好使用排枪分磁珠,正式分前先吹吸磁珠对枪头进行润洗,吸取磁珠后观察页面是否平齐,润洗并页面平齐后再分到所需的管子中。如中间需更换枪头,请注意枪头插取方式及力度与上次基本一致。


室温孵育

样本与磁珠混合后一定要按照说明进行孵育,此步至关重要。


上清去除

有buffer存在的磁珠放到磁力架上去上清时,结合并不牢固,因此此时去上清允许底部有残留,以避免吸到磁珠,影响后续吸附效果。后面加乙醇后磁珠结合较牢固,此时弃上清可将底部吸干。


酒精漂洗

一般使用75%~80%乙醇对磁珠进行漂洗,乙醇要现配现用。乙醇浓度越高,体系中水越少,清洗盐离子的能力减弱,但DNA的溶解度小,回收率高;酒精浓度越低,盐离子可以清洗得更干净,但DNA的回收率可能会收到影响。


磁珠干燥

磁珠干燥时不可过干,也不可不干。干燥过程中可用10uL枪头来吸取残留液体,尽量避免酒精残留,否则可能会对后续实验造成影响。磁珠过干又可能导致磁珠无法从管壁洗下,或无法吹匀,影响回收效率。磁珠干燥时一般以磁珠刚出现龟裂或管子中无明显液体、磁珠表面无水光为好。


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