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干货 | 认识更多微生物的技术——宏基因组

时间:2022-11-29   访问量:1390

环境微生物是自然界中分布最广、种类最多、数量最大的生物类群。人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的0.1%~1%,这使得微生物的多样性资源难以得到全面的开发和利用,如何充分开拓利用环境微生物新资源是目前环境微生物研究的重要课题之一。


近年来发展起来的宏基因组学技术避开传统的微生物分离培养方法直接从环境样品中提取总DNA,通过构建和筛选宏基因组文库来获得新的功能基因和生物活性物质,宏基因组文库既包括了可培养的,又包括了未可培养的微生物遗传信息,因此增加了获得新生物活性物质的机会。


宏基因组 ( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组)是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词,其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” ,即环境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因,目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。宏基因组学(或元基因组学,metagenomics)是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组DNA,进行高通量测序分析,或克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作。


特定生物种基因组研究使人们的认识单元实现了从单一基因到基因集合的转变,宏基因组研究将使人们摆脱物种界限,揭示更高更复杂层次上的生命运动规律。在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下,细菌宏基因组成为研究和开发的主要对象。细菌宏基因组、细菌人工染色体文库筛选和基因系统学分析使研究者能更有效地开发细菌基因资源,更深入地洞察细菌多样性。


01

在微生态学上的应用


张薇等采用宏基因组技术对西北黄土高原柠条种植区土壤微生物多样性进行分析, 发现变形杆菌纲是根表土壤区系中的有优势微生物菌群(70.3%), 尤其存在大量能够诱导植物形成根瘤的根瘤菌和对植物有促生长作用的γ-Proteobacteria 类微生物, 说明了植物根系和土壤环境微生物菌群具有相互选择性。


Fierer 等通过构建牧场、沙漠、雨林土壤宏基因组文库对环境中细菌、古生菌、真菌及病毒多样性进行了研究, 并揭示了土壤环境中包含着大量不可培养的新病毒种类, 其基因型特征与常规培养获得的病毒具有很大的差异性。


2005 年Cann 等通过构建宏基因组文库对马排泄物中的未培养病毒多样性进行研究, 经过测序鉴定, 获得233 种不同基因型的病毒, 其中52%为长尾噬菌体科, 26%为未分类的噬菌体, 17%为肌病毒科, 4%为短尾病毒科,2%为脊椎动物正痘病毒。


02

在海洋微生物资源开发上的应用


Martín 等构建地中海深层水体微生物宏基因组文库, 通过序列分析和16S rRNA 系统发育比对,发现该水体的微生物种群与太平洋阿罗哈水域中层水体的微生物种群具有一定的相似性, 并提出在无光的条件下, 温度是影响微生物种群在水体中分布的主要因素。


Sabet 等通过构建宏基因组文库对美国莫诺湖水体中噬菌体的多样性进行了研究, 研究发现不可培养的噬菌体才是该特殊生境中的优势群体, 揭示了海洋是一个巨大的未知RNA 病毒库。


Breitbart 等通过构建海水及海底沉积物宏基因组文库对该地区不可培养病毒的多样性进行分析, 结果发现扩增得到的病毒基因型中65%为新的基因型, 其中包含一类海藻病毒,多数病毒具有新的基因型, 与节肢动物和高等植物病毒存在很大的序列差异性。


03

在环境保护和污染修复上的应用


挖掘降解基因和功能菌株,进行生物修复。

获取任何序列的基因或功能,由此合成新物质或发现新的生物物种。

发掘极端环境为生物的新物种,了解其耐受机制,帮助极端环境的污染修复。

从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他活性成分、或可降解污染物功能的基因簇,以替代原有不易降解化合物,或直接降解环境中石油烃、有害有害化合物、重金属。

可以有效地从环境中分离新的基因、化合物和生物催化剂。

所构建的工程菌可用于处理各种复杂污染物,是非常有前景的降解酶系基因筛选方法。

所获取的多样性信息可以在废水处理的各种反应器系统、污染物降解过程中微生物的作用和调控、营养物循环和富营养作用的微生物生态、微生物对环境和气候的监测等研究中发挥作用。

分析微生物种群多样性,检测评价环境健康。


04

在医学领域的应用


早在2000 年, Wang 等构建土壤宏基因组文库, 通过文库筛选获得TerragineA 及其相关成分, 目前已广泛应用于医学治疗领域, 证明了自然环境中的丰富微生物代谢产物可以通过宏基因组技术为人们所利用; 2002 年Gillespie 等构建土壤宏基因组文库筛选获得两种抗菌物质Turbomycin A和B, 并且发现Turbomycin A 和B 对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌具有广谱抗菌活性;  2008 年Mori 等通过活性污泥宏基因组文库筛选获得两种不同的博来霉素抗性基因, 经过比对发现于来源放射菌类基因差异较大, 可能为新的博来霉素抗性基因。


国内在利用宏基因组技术获取新型药物的研究较少, 尚处于萌芽阶段, 赵晶等从南极中山站排污口采集污泥,构建宏基因组文库, 并通过差异性DNA 修复实验(DDRT)筛选得到具有抗肿瘤效应的物质。同时利用宏基因组技术研究探讨人类肠道中不可培养微生物多样性也有了很大进展。如Kurokawa 等利用宏基因组技术对13 个处于不同年龄层的健康人体粪便微生物种群进行了研究, 结果分析表明未断奶婴儿的肠道微生物种群在系统发育和基因组成上具有较大个体差异性, 而在成人及已断奶儿童则呈现出高度的功能一致性, 并对成人及婴儿肠道内编码该生境微生物主要功能的基因家族的特性进行分析, 发现了一个新的人类肠道微生物基因家族和一个共扼转座子。随着宏基因组技术的成熟, 必将加快宏基因组技术在医学中的应用。在人体微生物抗药性的研究, 人体与不可培养病原菌的相互关系的探索等方面将做出重大贡献。


05

在生物酶制剂开发中的应用


近年来研究者们已成功构建了土壤、海底淤泥、温泉淤泥、油厂污泥、动物瘤胃内容物、动物粪便等宏基因组文库,并筛选到脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、乙醇氧化酶、木聚糖酶、纤维素酶及脱羧酶等酶制剂, 并且在此基础上获得新酶的许多特征信息。所采用的载体种类十分广泛, 包括Fosmid、Cosmid、BAC、λ噬菌体以及各种穿梭载体, 所采用的宿主系统为常用的大肠杆菌、链霉菌和假单胞菌等。通过宏基因文库筛选得到的生物分子大多数与已知的基因产物相似性差或者完全是新的分子, 这些新的生物分子主要来源于环境未培养微生物的基因和其多样的代谢物。

环境样品DNA 的克隆和筛选只是所有环境遗传信息多样性的一小部分, 环境微生物和宏基因组的多样性仍旧是发现新的天然活性产物的丰富广阔资源, 为研究者们探索开发新的生物催化剂提供了巨大的资源空间。


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