产品动态

1、Smart-seq2

微孔板；低通量

2、CEL-Seq2

微孔板；低通量

3、sci-RNA-seq

微孔板的组合，标识细胞；高通量

4、10x Chromium

微流控产生，油包水，带 barcode 微珠；高通量

5、Drop-seq

微流控产生，油包水，带 barcode 微珠；高通量

6、Seq-Well

微孔芯片，带 barcode 微珠；高通量

7、inDrops

微流控产生，油包水，带 barcode 微珠；高通量

1、样品类型一：

把人的HEK293培养细胞、和小鼠的NIGH3T3培养细胞，进行等比例混合，把混合细胞作为检测样本。

之所以用两个物种的混合细胞，是想检测一个细胞Barcode中混有多个细胞的情况，以及单个细胞中混有别的细胞的RNA的情况。

2、样品类型二：

人的外周血单核细胞，也就是PBMC细胞。

因为外周血中的细胞天然是分离的，细胞与细胞之间没有粘连，这可以排除用组织样本做实验时，会引入的细胞消化的问题。

3、样品类型三：

小鼠的脑皮层的细胞核。

一方面是想看一下各种检测方法对细胞核的检测效果，因为小鼠的脑皮层的细胞核样本，已经被广泛鉴定过，有好的学术研究背景；另一方面，是因为小鼠的脑皮层的细胞中有许多是长条形的，也有星型的、多角型的形状的，所以用圆球形的细胞核，来代替形状各异的细胞做单细胞实验，是一种较为方便的方法。

在一个实验中心的六个独立实验室中生成了36个文库进行测,开发统一的计算管道，并消除了各种方法之间各自计算通道之间引入的处理差异，把多种scRNA-seq方法进行统一分析。

作者通过几个关键指标来评估这7种方法：

1.reads比对到基因组的结构，有多少是比对到外显子的，有多少是比对到内含子的，有多少是比对到基因间的位置的以及其它的序列。

<分别是：混合细胞、PBMC细胞、脑皮层的细胞核>

结果：在混合细胞样本的实验中，Smart-Seq2 的两个重复实验，和 inDrops 的一个实验，得到了比例最高的外显子 reads，这三个的外显子 reads 数达到 50% 以上。而 sci-RNA-seq 表现最差，外显子的比例是 28.7% 和 29.4%。

与混合细胞样本相比，PBMC 的外显子比例较低，只有 inDrops 的一个实验达到了 46%。

脑皮层的细胞核的样本，得到的 reads 中，内含子相对于外显子的比例，要更高。这和作者的预期是一致的。因为细胞核中包含了更多的没有经过剪切的转录本。

2、捕捉RNA分子的敏感性，也就是从一个细胞中能捕捉到多少个UMI，和多少种基因。

<6种方法每个细胞中UMI的数量统计>

总体来看，因为 Smart-seq2 方法本身没有 UMI，所以这张图里面没有 Smart-seq2 的结果。我们看这张图，CEL-Seq2 方法，因为输入的细胞数少，所以每个细胞得到的 UMI 数量明显多于其它几种方法。在剩下的 5 种高通量方法中，10x Chromium 的方法，得到的每个细胞的 UMI 数量是最多的。

<混合样品中各种方法检测到的每个细胞中UMI的数量>

混合样品中：Smar-seq2 和 CEL-seq2 这两个低通量的方法检测到的每个细胞中的基因数最多。剩下的 5 种方法中10x Chromium 方法得到的基因数量最多。Indrops 和 Drop-seq 方法得到的基因数量最少。

<左图：PBMC单个细胞的UMI数量分布  右图：PBMC个细胞基因数量分布>

PBMC细胞中的结果：和前面混合细胞的情况是差不多的。低通量的办法，每个细胞可以测到更多的 UMI 数量和更多的基因数量。在高通量的办法中，10x Chromium 的方法可以测到更多的 UMI 数量和更多的基因数量。

小鼠脑皮质细胞核中的结果：低通量Smart-seq2每个细胞检测到了最多的基因数量。高通量10x chromium得到了最多的UMI数量和最多的基因数量。

<相同测序深度每个细胞中检测到的基因数量>

<每个细胞中测到的 UMI 数量与测到的基因数量的关系>

各个方法，在每个细胞取相同的测序深度下，每个细胞中能够检测到的基因数量进行比较。左边的两张图是两个低通量方法的结果，两个低通量方法的结果差别不太大，右边的两张图是高通量方法的结果。在高通量方法中，10x Chromium 的方法，在相同的测序深度条件下，可以测到更多的基因。且每个细胞中测到的UMI数量与测到的基因数量有线性关系。

3.混合细胞样本的实验中一个细胞Barcode对应到多细胞的出现比例

<混合细胞>

混合细胞中的结果：通过检测一个细胞 barcode 中，是否包含两个物种的序列，来判断多细胞的情况。所有的检测结果，多细胞的比例都低于 3.5%，除了一个 inDrops 的实验结果是 8.0%。

4、估计基因表达方面的技术精度、和重现性。

<混合样品中重现性>

CEL-Seq2、inDrops 和 Drop-seq 始终具有相对较低的超出泊松分布之外的变异系数。三种方法的实验结果可重复性较高。Smart-seq2实验结果可重复性较低。

5、在对细胞进行聚类，找出各种细胞类型的能力。

在 scRNA-seq 研究的众多生物学特征中，最突出的实用例子之一，就是通过聚类 scRNA-seq 来识别不同的细胞类型。

<PBMC t-SNE图>

PBMC细胞中的结果：10x Chromium 和 inDrops 的表现良好。通常，大多数方法成功地找出了 PBMC 中丰富的细胞类型。但是，对于稀有的细胞类型，如浆细胞样树突细胞、和血小板，这些细胞在不同的方法中，以不同的比例被捕获。

<小鼠皮层t-SNE图>

小鼠皮层细胞中的结果：也具有明确定义的多种细胞类型。3 种方法找到了要找的各种细胞类型。而 sci-RNA-seq 这个方法，没有找到全部的细胞类型。

1、低通量的两个方法，有更好的检测敏感度，在每个细胞中找到了更多的基因。

2、在5个高通量的方法中，10x Chromium是检测敏感度最高的方法，并且有最高的找出各种细胞类型的能力。

3、在所有的方法中，因为10x Chromium是经过商业化包装的，所以易用性最好。