简化基因组2b-RAD

2b-RAD技术使用IIB型限制性核酸内切酶（如BsaXI）对基因组DNA进行酶切，切割位点位于识别位点的左右两侧，酶切后产生等长的33 bp的标签，这些标签经过富集后用于高通量测序，通过生物信息学分析实现全基因组范围高通量SNP筛查和分型分析。

技术流程

技术特点

（1）适用于降解样品、痕量样品（ng级DNA）

在所有简化基因组技术中，2b-RAD对DNA质量的要求是最低的，许多存在DNA降解或严重降解的样本，对其他简化基因组技术来讲是完全不符合建库要求的，2b-RAD凭借其标签短的特点，能很好的对降解样本进行建库测序，已有多篇此类案例文章发表，比如东方蜜蜂（Li et al. BMC Genomics, 2019）、中华绒螯蟹（Cui et al. Heredity, 2015）。

（2）技术重复性好，标签长度一致、测序深度均一，SNP准确性和利用率高

RAD、SLAF、GBS等技术是用超声波打断基因组DNA或双酶切后人工切胶获得目标片段的，随机性强，易引入人为误差。2b-RAD使用的是IIB型的限制性内切酶进行单酶切，这类酶的特点是能在识别位点的两侧进行双链切断，这样获得的目标片段都是等长的（下图），避免了像其他简化基因组技术那样，必须经过片段选择而导致部分信息的损失。而且由于片段等长，不会像其他技术那样存在PCR扩增偏好性，SNP分型更准。此外，不同时间送的样本基本不受批次效应影响，可合并分析。此类酶切识别位点在基因组上大致上是每3-4Kbp就会出现一次。这就保证了标签分布均匀。

IIB型内切酶酶切标签图解

（“红色碱基”为酶切识别位点，左右两侧切割产生粘性末端，切割位点与识别位点的相对距离是固定的，基因组各位置切下来的标签等长）

（3）助力发高水平文章

2b-RAD技术2012年发表在方法学权威期刊 《Nature Methods》 上，其他技术（像RAD、GBS、SLAF）均发表在《Plos One》上，影响力差异巨大。2012年发表至今，各领域科研人员已使用2b-RAD技术发表130多篇文章，其中不乏Science、Nature Protocol、Molecular Ecology、Heredity、New Phytologist、Proceedings of the Royal Society等高水平期刊。

（4）免费赠送大片段缺失分析

由于我们的标签有稳定重现的特点，因此可以对有参物种，或者拼接到染色体水平的基因组物种，额外免费赠送大片段缺失的数据分析。这是其他简化基因组技术实现不了的。

（5）项目经验丰富

我们现在已做物种涵盖动物、植物、微生物，共有150多种；已与国内100多家科研单位建立合作，基因组有大有小（大肠杆菌~5M，百合~17G），且有参、无参均可。

样本要求

2b-RAD 对DNA质量要求低，极其微量，降解很严重时依然可以尝试建库，且有较高建库成功率（90%以上）

(1) DNA需用ddH2O或者1/10 TE溶解；
(2) 质检电泳图谱条带单一，无降解；
(3) 浓度>50ng/μL，总量>500ng，260/280值1.8~1.9，260/230值1.9~2.3；
(4) 总量<250ng不足一次建库DNA用量，需客户重新送样；

DNA降解但仍有主带存在可风险建库，降解严重的样品风险较高，不建议建库。

常见问题

1：2b-RAD所用的酶是一种什么类型的酶？这种酶有什么特性？如何进行选择？

2b-RAD所使用的是IIB型限制性核酸内切酶，是一类商业化的酶。这类酶在基因组上识别特定的碱基序列（一般为5-7碱基），然后在识别位点两侧进行双链酶切，全基因组范围内切出的标签片段等长，如：内切酶BsaXI切出的为等长的33 bp片段。针对有参物种，可通过对基因组进行电子酶切结合预期的标签数确定合适的酶，对于无参物种则可选用其近缘物种基因组序列进行电子酶切。

2：存放了许久的样品或者发生降解的DNA能进行2b-RAD测序吗？

完全可以。这正是2b-RAD技术的一大优势，该技术的酶切标签为长度一致的短片段（~33bp）,一定程度的DNA降解并不会影响实验结果。经实验证明，50bp的片段也可建库成功。