产品介绍
2022 年 1 月 26 日，Genome Biology（IF：13.518）在线发表了由中国科学院青岛生物能源与过程研究所、中国海洋大学和欧易生物联合研发、共同署名的题为“Species- resolved sequencing of low-biomass or degraded microbiomes using 2bRAD-M”的技术文章。自此诞生了新的微生物组测序技术——2bRAD-M，该技术起源于 2bRAD 简化基因组测序技术（Nature Methods, Wang et al. 2012），通过 IIB 型限制性内切酶对微生物基因组酶切后获得的唯一标签（unique tag)进行微生物定性和相对定量分析，较传统微生物组测序技术有明显的技术特色和优势。
2bRAD-M技术文章下载链接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02576-9
技术原理
2bRAD-M 技术原理如下图所示：采用 IIB 型限制性内切酶对基因组酶切，可产生 等长的酶切标签 tag（如，BcgI 酶可获得 32bp 等长标签），对 IIB 酶切标签进行扩增和 测序，然后通过“两步法”对微生物群落结构进行分析（包括细菌、真菌、古菌）。第一 步，我们通过预先建立的含有每种微生物 unique tag 的数据库（2b-Tag-DB）进行定性分 析，即筛选所有可检测到 unique tag 的微生物物种。第二步，对定性的微生物再次建立 2b-Tag-DB 并进行相对定量分析，即对上一步得到的微生物物种，根据 unique tag 分布 进行进一步的筛选和丰度估计。该策略能够高准确度、高灵敏度地检出微生物，可以同时检出细菌、真菌和古菌。
技术特点及优势
种水平（species level）的物种检测分辨率
一次测序可同时检测细菌、真菌和古菌
高效处理疑难样本：低生物量（pg级别DNA）、严重降解样本（如FFPE）、高宿主污染样本等
高灵敏度：对丰度较低的微生物种类也有较高的检出能力
技术文章影响因子高：欧易生物共同署名发表在《Genome Biology》，IF：17.906
最新微生物组测序技术，具有创新性
欧易生物独家科研服务技术，已获批技术专利（ZL 201811467986.8）和技术商标；
技术对比
1. 2bRAD-M—VS—16S
优点：
① 种水平分辨率
② 一次实验同时检测细菌、真菌、古菌
③ 准确度灵敏度更高（2bRAD-M测的是覆盖整个基因组范围的tags，16S只测了16S基因的某段区域）
缺点：费用会略高于16S
2. 2bRAD-M—VS—宏基因组测序（WMS）
优点：
① 2bRAD-M对DNA质量要求较低，可以做宏基因组测序做不了的低生物量或严重降解的样本
② 2bRAD-M可以很好的应对高宿主污染的样本（组织/血液/拭子等）
③ 2bRAD-M较宏基因组测序费用低
缺点：目前不能检测病毒、不能分析基因的功能
表1 2bRAD-M、16S 和宏基因组（WMS）三种技术比较
分析内容展示
应用案例
高生物量样本（粪便）
2bRAD-M可以用于高生物量样本的分析，以下是最常见的、能反应肠道菌群的粪便样品的检测情况。在属水平，2bRAD-M与16S rRNA相比较，二者的微生物分类结果高度一致，相关性系数Pearson R=0.997，L2=92.0%；16S rRNA检出的大部分属（98.61%）在2bRAD-M中均检测到（见下图a,b,c）。在种水平，2bRAD-M与宏基因组相比较，二者的微生物分类结果一致性高，相关性系数Pearson R=0.974，L2=88.6%；宏基因组鉴定到的种水平物种，平均 99.92% 也被2bRAD-M检测到（见下图d,e,f）。
2bRAD-M、16S rRNA、宏基因组在粪便样品的结果比较
低生物量样本（皮肤）
2bRAD-M可以用于低生物量样本的分析，如皮肤、拭子等。以皮肤样本为例，在属水平，2bRAD-M与16S rRNA相比较，二者的微生物分类结果高度一致，L2=81.1%。两种方法均发现葡萄球菌属和棒杆菌属是优势微生物，2bRAD-M在种水平上进一步发现，葡萄球菌属中丰度最高的是表皮葡萄球菌，而其他葡萄球菌没有显著差异，这是16S rRNA无法做到的。同时，2bRAD-M还检测到真菌，Malassezia restricta 和 Malassezia globose是丰度最高的菌，这两种菌是已知的人体皮肤表面共生菌。
2bRAD-M可在低生物量样本中同时检测细菌和真菌
降解样本（FFPE）
2bRAD-M可以用于降解样本的检测，如石蜡样本（FFPE）、酒精或福尔马林保藏的样本、考古样本等，该类样本存在严重DNA降解、低生物量、高宿主污染、化学交联等问题。宫颈癌的癌旁（H）、良性宫颈癌（PreC）、恶性宫颈癌（InvaC），每种样本1张切片（4µm厚，3cm2），16S rRNA和宏基因组均建库失败。2bRAD-M分析显示，癌旁的alpha多样性显著低于PreC和InvaC（p<0.05）。PreC、InvaC和癌旁富集的菌株不同，PreC和InvaC显著富集Methyloversatilis discipulorum, Mycobacterium 290 tuberculosis, Methyloversatilis universalis, Ferrovibrio K5 291, Pseudomonas aeruginosa；癌旁显著富集乳酸菌，包括L. paracasei, L. 293 vaccinostercus, L. pentosus, L. plantarum。基于2bRAD-M检出结果，成功获得能够区分癌和癌旁的生物标志物。
2bRAD-M 分析FFPE样本的微生物。a 为每组的Shannon指数；b为每组的差异微生物；c为三元相图，用于展示每组可能的生物标志物
常见问题
1. 微生物组测序，必须要测整个基因组才能达到种水平的分辨率吗？
答：并不是。2bRAD-M技术简化了整体基因组实现高效成本控制，并达到微生物种水平鉴定的分辨率。我们在计算上模拟了一个典型的宏基因组数据，并充分比较了全基因组和简化基因组在物种鉴定中是否存在差异。首先，我们从NCBI Refseq下载173,165个微生物基因组（171,927 细菌、293真菌、945古菌），用一种IIB酶进行电子酶切。例如，BcgI酶可在每个基因组产生3,010个等长标签，平均每个基因组种水平的unique tag为39.7%，这些unique tag就可用于种水平微生物鉴定和分类的标志物。总体来看，简化基因组标签数和GC含量与全基因组高度相关（r>0.98）。其次，通过50个物种的模拟宏基因组数据分析，我们发现2bRAD-M技术的精确率（98.0%）、召回率（98.0%）和L2相似性（96.9%）都非常高。因此，虽然2bRAD-M是一种简化宏基因组测序技术，只获得1%左右的基因组信息，但这1%的信息对整个基因组是具有代表性的，而且还提供准确的微生物群落结构。
2.高宿主污染样品，宏基因组一般会获得很多无用的数据，2bRAD-M也是如此吗？
答：2bRAD-M技术能克服高宿主污染，原因有三方面：
（1）2bRAD-M通过对具有代表性的1%的人类基因组和微生物基因组进行测序，大幅降低样品总体测序成本，并大幅增加了每个生物个体的测序深度。
（2）由于微生物基因组和人类基因组中酶切位点的高度不平衡，微生物基因组可以产生比人类基因组更多的2bRAD标签。例如，如果微生物DNA标准品(Mock-CAS)与人类DNA的比例为1:99，在实际测序结果中，二者的测序reads比例将变为3:97。
（3）人类基因组中的2bRAD标签与微生物基因组中的2bRAD标签完全不同。因此，2bRAD-M技术能有效抵抗宿主DNA干扰，大大降低假阳性率。而且，我们通过针对两种标准品（Mock-CAS: 含5种微生物的模拟菌群，ATCC MSA 1002: 含20种微生物的模拟菌群）的测试，也充分证实了2bRAD-M技术可处理高达99%宿主污染的样本（下图）。
3.如果我的样本生物量/核酸量很低，有办法使用2bRAD-M检测其中的微生物吗？
答：可以的。通过针对两种标准品（Mock-CAS和ATCC MSA 1002）的分析， 我们已证明2bRAD-M技术能够有效处理低生物量微生物样本，可应对总DNA仅为1pg的样本，并且已成功应用到皮肤、室内地毯、汽车垫子等低生物量样本的检测中。以皮肤样本为例，在属水平，2bRAD-M与16S的微生物分类结果高度一致，均发现葡萄球菌属是优势微生物；但2bRAD-M可在种水平上进一步发现，葡萄球菌属中丰度最高的是表皮葡萄球菌，该属其他种没有显著差异，这是16S无法做到的。同时，2bRAD-M还检测到真菌，可在种水平揭示低生物量微生物群落新的细菌-真菌相互作用。
总结：2bRAD-M技术具有高性价比、高灵敏度、种水平分辨率、同时检测三大菌（细菌/真菌/古菌）的特点，并且能够有效地处理低生物量微生物样本、降解样本和高宿主污染样本。
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