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膜体系酵母文库构建

上架时间:2021-11-05
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产品介绍


酵母双杂交(Yeast two hybrid)技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用,被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域,已成为分子生物学研究领域的重要实验手段。

经过不断的完善和发展,不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用,更重要的在于还可发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

传统的酵母双杂交系统仅限于核蛋白的互作分析,不能进行膜蛋白的研究。DUALmembrane 系统是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统,它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法使得分析膜蛋白间的互作成为现实。

其主要特点是可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究,既可以用于表达文库的筛选,也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的验证。




DUAL membrane 系统


在酵母细胞中,泛素可分为两部分表达,即 N 端部分(NubI)和 C 端部分(Cub)。后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA 蛋白,NubI 和 Cub-LexA 在细胞中组成可分离的泛素蛋白([NubI:Cub]-reporter)体系




欧易特色


十余年文库技术积淀,具有丰富的样品处理经验和建库经验

可提供膜体系酵母双杂交文库服务

可构建普通酵母双杂交文库和均一化酵母双杂交文库

帮助用户获得高质量的膜体系酵母双杂交文库



提供内容


实验报告:详细实验流程、各阶段电泳图、文库库容量、插入片段长度鉴定图等
文库质粒200μg以上
Gateway 体系可提供初级、次级文库质粒及菌液



近三年部分项目文章列表(膜体系)


膜体系酵母文库.png





项目案例


PROTEIN PHOSPOHATASE 95 Regulates Phosphate Homeostasis by Affect-ing Phosphate Transporter Trafficking in Rice

磷素平衡:水稻磷素平衡的重要调控通路

发表期刊:Plant Cell   | 影响因子: 8.631 



研究背景


磷是植物生长发育必需的大量营养元素之一。植物磷的吸收很大程度上依赖于质膜定位的磷酸盐转运体 PT 蛋白。PT蛋白在植物不同组织部位表达存在很大差别。同时在转录后水平上,PT 蛋白也会发生一系列的修饰事件。蛋白磷酸化是一个可逆的过程,然而是否有蛋白磷酸酶调控 PT 去磷酸化及植物磷平衡并不清楚。


主要结果


该研究揭示了水稻磷素平衡的重要调控通路:蛋白磷酸酶 PP95 通过调控水稻磷转运体的磷酸化水平,从而影响其从内质网向质膜的转运及植物体内磷稳态。


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参考文献


Yang Z, Yang J, Wang Y, et al. PROTEIN PHOSPOHATASE 95 Regulates Phosphate Homeostasis by Affect-ing Phosphate Transporter Trafficking in Rice. Plant Cell 2020.32(3):740-757.


文章解读


https://mp.weixin.qq.com/s/to2vDuNucfEGGY48c0D3KQ



常见问题



1.构建核体系文库还是膜体系文库,如何选择?

需要老师对目标诱饵基因有详细的了解:

特别提醒:选择膜体系筛库需先进行功能验证实验,功能验证通过后才可以进行文库筛选,如果功能验证未通过,可以尝

试去掉跨膜域更换为核体系,但存在蛋白空间结构发生变化的风险。


2.如何选择膜体系诱饵载体?

1637126555161859.png


3. 如何检测文库的库容、插入片段平均长度、重组率?

文库滴度(每毫升文库菌液库容量)的计算公式:

CFU/ml = 平板上的克隆数/平板上涂布菌液的体积 μl×n×1000μl

其中 n 是原始菌液的稀释倍数;总的文库库容(CFU)= CFU/ml ×文库菌液的总体积(ml)

插入片段平均长度:随机挑取 24 个菌落 PCR 所得到的插入片段长度的总和的平均值

重组率:根据菌落 PCR 中所有阳性插入片段的克隆在总检测克隆数中所占比例


4.酵母菌落为什么变红色? 

形态正常,只是菌落颜色变红不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的 Adenine 

被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine以供利用。然而有些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine合

成途径受阻;又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常,所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而

使菌落变为粉红色。

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